ANALISIS DNA

                                                       ANALISIS DNA             

Beberapa teknik analisis keanekaragaman genetik seperti RAPD, RFLP, dan DGGE membutuhkan amplifikasi daerah genom tertentu dari suatu organisme. Amplifikasi ini membutuhkan primer spesifik (sekuen oligonukelotida khusus) untuk daerah tersebut. Primer biasanya terdiri dari 10-20 nukleotida dan dirancang berdasarkan daerah konservatif dalam genom tersebut. Makin panjang primer, makin harus spesifik daerah yang diamplifikasi. Jika suatu kelompok organism memang berkerabat dekat, maka primer dapat digunakan untuk mengamplifikasi daerah tertentu yang sama dalam genom kelompok tersebut. Beberapa faktor seperti konsentrasi DNA contoh, ukuran panjang primer, komposisi basa primer, konsentrasi ion Mg, dan suhu hibridisasi primer harus dikontrol dengan hati-hati agar dapat diperoleh pita-pita DNA yang utuh dan baik. Keberhasilan teknik ini lebih didasarkan kepada kesesuaian primer dan efisiensi dan optimasi proses PCR. Primer yang tidak spesifik dapat menyebabkan teramplifikasinya daerah lain dalam genom yang tidak dijadikan sasaran atau sebaliknya tidak ada daerah genom yang teramplifikasi.

Penemuan awal dari teknik PCR didasarkan pada tiga waterbaths yang mempunyai temperatur yang berbeda. Thermal-cycler pertama kali dipublikasikan pada tahun 1986, akan tetapi DNA polymerase awal yang digunakan masih belum thermostable, dan harus ditambahkan disetiap siklusnya. Kelemahan lain, temperature 37°C yang digunakan bias dan menyebabkan non-specific priming, sehingga menghasilkan produk yang tidak dikehendaki. Taq DNA polymerase yang diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) dikembangkan pada tahun 1988.  Ensim ini tahan sampai temperature mendidih 100°C, dan aktifitas maksimal pada temperatur 92-95°C. Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi oleh enzim DNA polimerase. Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5’ menuju ujung-3’ untai DNA target dan mengamplifikasi untuk urutan yang diinginkan. Dasar siklus PCR ada 30-35 siklus meliputi: denaturation (95°C), 30 detik; annealing (55–60°C), 30 detik; extension (72°C), waktu tergantung panjang pendeknya ukuran DNA yang diinginkan  sebagai produk amplifikasi.

Peningkatan jumlah siklus PCR diatas 35 siklus tidak memberikan efek yang positif. Sejak penemuan RNA sebagai bahan genetik dari virus dapat membetuk cDNA (complementary DNA) dengan enzim reverse transcriptase. Kemudian cDNA ini akan melanjutkan sintesis protein secara normal. Penemuan ini menjadi dasar pengembangan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) dalam membuat cDNA secara in vitro dengan teknik reverse transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Untuk mengalisis gene profiling dikembangkan teknik microarray dengan menggunakan real-time PCR sebagai alat Bantu untuk menghitung kandungan mRNA secara tepat dari berbagai macam gen-gen yang diteliti. Real-time PCR juga dapat digunakan untuk menghitung jumlah copy DNA secara akurat dan beberapa fungsi lain.

Optimasi PCR juga diperlukan untuk menghasilkan karakter yang diinginkan. Optimasi ini menyangkut suhu denaturasi dan annealing DNA dalam mesin PCR. Suhu denaturasi yang rendah dapat menyebabkan belum terbukanya DNA utas ganda sehingga tidak dimungkinkan terjadinya polimerisasi DNA baru. Proses penempelan primer pada utas DNA yang sudah terbuka memerlukan suhu optimum, sebab suhu yang terlalu tinggi dapat menyebabkan amplifikasi tidak terjadi atau sebaliknya suhu yang terlalu rendah menyebabkan primer menempel pada sisi lain genom yang bukan sisi homolognya; akibatnya dapat teramplifikasi banyak daerah tidak spesifik dalam genom tersebut. Suhu penempelan (annealing) ini ditentukan berdasarkan primer yang digunakan yang dipengaruhi oleh panjang dan komposisi primer. Suhu penemelan ini sebaiknya sekitar 5°C di bawah suhu leleh. Secara umum suhu leleh (Tm) dihitung dengan rumus Tm = 4(G+C) + 2(A+T)°C (Rybicky, 1996). Berikut ini disajikan contoh hasil amplifikasi gen 16S-rRNA pada gel elektroforesis dari bakteri dengan primer domain Bacteria 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC) (Marchesi et al., 1998).